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夾心ELISA實(shí)驗(yàn)操作步驟
雙抗體夾心法，其基本原理是將一定量的包被抗體以物理吸附的方法固定于聚苯乙烯微孔板表面，加入無關(guān)蛋白載體封閉未結(jié)合位點(diǎn)，然后加入含有抗原之待測(cè)樣品，通過加入酶標(biāo)記特異性抗體后用TMB底物顯色，微孔板中顏色的深淺與待測(cè)物的濃度呈正相關(guān)。該方法適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
一、實(shí)驗(yàn)步驟
1.用捕獲抗體包被
①以捕獲抗體濃度為1-10μg/mL的碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液 (pH9.6)包被PVC微量滴定板的孔。
②未純化抗體（例如腹水液或抗血清）可能需要增加樣品蛋白質(zhì)的濃度（嘗試用10μg/mL）補(bǔ)償濃度更低的特異性抗體。
③用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在4℃下孵育過夜。
④棄去包被液，并洗滌微量滴定板兩次，每次在微孔中加入200μLPBS。在水槽上方輕輕甩動(dòng)微量滴定板，除去溶液或洗滌液。在紙巾上輕拍微量滴定板，除去剩余的液滴。
2.封閉和加樣
①每孔添加 200μL 封閉緩沖液（5% 脫脂奶粉/PBS）封閉包被孔中剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育至少1-2小時(shí)，或在4℃下孵育過夜。
③用200 μL PBS洗滌微量滴定板兩次。
④將100 μL 稀釋樣品添加到每個(gè)孔。通常做法是比較未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的信號(hào)。每板都必須測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品（兩重測(cè)定或三重測(cè)定）和空白樣品。37°C條件下孵育90分鐘。確保標(biāo)準(zhǔn)品濃度涵蓋抗體結(jié)合的大部分動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍?？赡苄枰獌?yōu)化濃度范圍以獲得合適的標(biāo)準(zhǔn)曲線。通常樣品和標(biāo)準(zhǔn)品采取兩重測(cè)定或三重測(cè)定。
⑤移除樣品，用200μL PBS洗滌微量滴定板兩次。
3.用檢測(cè)抗體和二抗孵育
①將100μL稀釋的檢測(cè)抗體添加到每個(gè)孔。確保檢測(cè)抗體識(shí)別與捕獲抗體靶蛋白的不同表位。這可防止對(duì)抗體結(jié)合的干擾。盡可能使用已測(cè)試的成對(duì)匹配抗體。
②用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育2小時(shí)。
③用PBS洗滌微量滴定板四次。
④添加100μL偶聯(lián)二抗，使用將其在封閉緩沖液中稀釋。
⑤用粘合塑料制品覆蓋微量滴定板并在室溫下孵育1-2小時(shí)。
⑥用PBS洗滌微量滴定板四次。
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